Забор материала на пцр что это
что это такое, как проводится исследование, методы диагностики заболеваний
Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.
ПЦР-диагностика: суть подхода
Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.
После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.
Сферы применения метода
Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:
- ВИЧ;
- герпеса;
- различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
- кандидоза;
- гепатитов;
- мононуклеоза;
- листериоза;
- цитомегаловируса;
- туберкулеза;
- вируса папилломы человека;
- клещевого энцефалита.
Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.
Кстати
Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике, в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства.
Преимущества и недостатки подхода
У диагностики методом ПЦР много плюсов:
Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.
Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.
Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.
Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.
Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.
Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.
Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.
Исследуемый биоматериал
Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.
Подготовка к исследованию
Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.
Методы ПЦР-диагностики заболеваний
Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.
Расшифровка результатов
Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.
Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.
ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.
Для чего используется ПЦР? - Science Learning Hub
Этот интерактивный курс исследует ряд приложений, в которых используется полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для создания миллионов копий целевого участка ДНК. Это незаменимый инструмент в современной молекулярной биологии, который изменил научные исследования и диагностическую медицину.
ПЦР и ее разновидности имеют широкий спектр специализированных приложений и используются учеными во всех областях биологии.Результаты также используются учеными во многих других областях.
Читать Что такое ПЦР? для получения дополнительной информации о том, что участвует в процессе ПЦР. Современная биотехнология представляет некоторые способы, которыми ДНК-технологии изменили возможности ученых.
В этом интерактивном режиме вы узнаете о разнообразных технологиях, которые возможны благодаря ПЦР.
Благодарности
Science Learning Hub выражает признательность следующим правообладателям за использование их изображений в нашем интерактиве:
Медицинское изображение, Стивен Максуини, лицензировано через 123RF Ltd
Forensics fingerprint image, Arfo, лицензировано через 123RF Ltd
Food and Agriculture Sweetcorn image, Максим Народенко, лицензировано через 123RF Ltd
Genetics double helix image, Pedro Nogueira, лицензировано через 123RF Ltd
Стенограмма
Экологическая микробиология
ПЦР способствует нашему пониманию многих экологических проблем, особенно в тех случаях, когда обнаружение микроорганизмов в окружающая среда не требуется.ПЦР позволяет идентифицировать и количественно определять конкретные виды-мишени, даже если их количество очень мало. Одним из распространенных примеров является поиск патогенов или индикаторных видов, таких как колиформные бактерии, в системах водоснабжения.
Узнайте, как ученые использовали ПЦР для изучения окружающей среды в разделах «Разработка анализа», «Обнаружение вирусов в окружающей среде», «Жизнь в верхних слоях тропосферы» и «Охотники за вирусами».
Для размышления:
Как население, мы становимся больше осознают важность качества воды.Кто должен следить за качеством воды? Кому следует предоставить доступ к информации о качестве воды? Кто несет ответственность за поддержание хорошего качества воды?
Благодарности:
Изображение предоставлено Пламеном Петровым, лицензировано через 123RF Ltd.
Потребительская геномика
.Полимеразная цепная реакция (ПЦР): принцип, процедура, компоненты, типы и применение
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это лабораторный метод репликации ДНК, который позволяет избирательно амплифицировать «целевую» последовательность ДНК. ПЦР может использовать самый маленький образец ДНК для клонирования и усилить его до миллионов копий всего за несколько часов.
Открытая в 1985 году Керри Маллисом, ПЦР стала незаменимым и рутинным инструментом в большинстве биологических лабораторий.
Принцип ПЦР
ПЦР включает ферментативную амплификацию ДНК, опосредованную праймером . ПЦР основана на использовании способности ДНК-полимеразы синтезировать новую цепь ДНК, комплементарную предлагаемой цепи матрицы.
Праймер необходим, потому что ДНК-полимераза может добавлять нуклеотид только к уже существующей 3'-ОН группе, чтобы добавить первый нуклеотид. Затем ДНК-полимераза удлиняет свой 3-конец, добавляя больше нуклеотидов, чтобы создать расширенную область двунитевой ДНК.
Компоненты ПЦР
Для реакции ПЦР требуются следующие компоненты:
- Матрица ДНК : представляющая интерес двухцепочечная ДНК (дцДНК), выделенная из образца.
- ДНК-полимераза : Обычно термостабильная полимераза Taq, которая не денатурирует быстро при высоких температурах (98 °) и может функционировать при оптимальной температуре около 70 ° C.
- Олигонуклеотидные праймеры : короткие фрагменты одноцепочечной ДНК (часто 20-30 пар оснований), которые комплементарны 3 ’концам смысловой и антисмысловой цепей целевой последовательности.
- Дезоксинуклеотидтрифосфаты : отдельные единицы оснований A, T, G и C (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) обеспечивают энергию для полимеризации и строительные блоки для синтеза ДНК.
- Буферная система : включает магний и калий для обеспечения оптимальных условий денатурации и ренатурации ДНК; также важен для активности, стабильности и точности полимеразы.
Процедура ПЦР
Все компоненты ПЦР смешивают вместе и проводят серию из 3 основных циклических реакций, проводимых в автоматическом автономном термоциклере.
- Денатурация :
Эта стадия включает нагревание реакционной смеси до 94 ° C в течение 15-30 секунд. Во время этого двухцепочечная ДНК денатурируется в одноцепочечные из-за разрыва слабых водородных связей. - Отжиг :
Температуру реакции быстро понижают до 54-60 ° C в течение 20-40 секунд. Это позволяет праймерам связываться (отжигаться) с их комплементарной последовательностью в матричной ДНК. - Удлинение :
Этот этап, также известный как удлинение, обычно происходит при 72-80 ° C (чаще всего 72 ° C).На этом этапе фермент полимераза последовательно добавляет основания к 3'каждому праймеру, удлиняя последовательность ДНК в направлении от 5 'к 3'. В оптимальных условиях ДНК-полимераза будет добавлять около 1000 пар оснований в минуту.
За один цикл одиночный сегмент матрицы двухцепочечной ДНК амплифицируется в два отдельных фрагмента двухцепочечной ДНК.
Эти две части затем доступны для амплификации в следующем цикле. По мере повторения циклов создается все больше и больше копий, и количество копий шаблона увеличивается в геометрической прогрессии.
Типы ПЦР
В дополнение к амплификации последовательности целевой ДНК с помощью уже описанных типичных процедур ПЦР, для конкретных приложений было разработано несколько специализированных типов ПЦР.
- ПЦР в реальном времени
- Количественная ПЦР в реальном времени (Q-RT PCR)
- ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR)
- Мультиплексная ПЦР
- Вложенная ПЦР
- Длинная ПЦР
- Одноячеечная ПЦР
- ПЦР с быстрым циклом
- ПЦР, специфичная для метилирования (MSP)
- ПЦР с горячим стартом
- ПЦР с высокой точностью
- ПЦР на месте
- ПЦР с переменным числом тандемных повторов (VNTR)
- Асимметричная ПЦР
- Повторяющаяся последовательность- ПЦР на основе
- Расширение перекрытия ПЦР
- Соберите ПЦР
- ПЦР, специфичную для межпоследовательностей (ISSR)
- ПЦР, опосредованную лигированием
- ПЦР с метилированием-специфином
- ПЦР с минипраймером
- ПЦР на твердой фазе
- ПЦР с прикосновением и т. д.
Применения ПЦР
Некоторые общие применения ПЦР в различных областях можно объяснить в следующих категориях.
Медицинские приложения:
- Генетическое тестирование на наличие генетических мутаций заболевания. Например: гемоглобинопатии, муковисцидоз, другие врожденные нарушения метаболизма
- Выявление генов, вызывающих заболевание, у подозреваемых родителей, которые выступают в качестве носителей.
- Изучение изменения онкогенов может помочь в настройке терапии
- Может также использоваться как часть чувствительного теста для типирования тканей, жизненно важного для трансплантации органов
- Помогает контролировать ген в генной терапии
Инфекционный Заявки на заболевания:
- Анализ клинических образцов на наличие инфекционных агентов, включая ВИЧ, гепатит, малярию, туберкулез и т. д.
- Обнаружение новых вирулентных подтипов организмов, ответственных за эпидемии.
Приложения для судебной экспертизы:
- Может использоваться в качестве инструмента для генетической дактилоскопии. Эта технология может идентифицировать любого человека из миллионов других в случае: места преступления, исключения подозреваемых во время полицейского расследования, проверки на отцовство даже в случае наличия очень небольшого количества образцов (пятна крови, спермы, волос и т. Д.)
Исследования и молекулярная генетика:
- В геномных исследованиях: ПЦР помогает сравнить геномы двух организмов и определить разницу между ними.
- В филогенетическом анализе. Незначительные количества ДНК из любого источника, такого как окаменелость, волосы, кости, мумифицированные ткани.
- В исследовании анализа экспрессии генов, мутагенеза на основе ПЦР.
- В проекте «Геном человека» с целью завершения картирования и понимания всех генов человека.
Что такое ПЦР? - Science Learning Hub
ПЦР - это сокращение для простой, но очень полезной процедуры в молекулярной биологии, которая называется олимераза p c hain r eaction . Это метод, используемый для амплификации интересующего сегмента ДНК или получения множества копий. Другими словами, ПЦР позволяет получить миллионы копий определенной последовательности ДНК из изначально небольшого образца - иногда даже одной копии. Это важнейший процесс для ряда генетических технологий, который фактически позволил разработать ряд новых технологий.
Как работает ПЦР?
ПЦР имитирует то, что происходит в клетках, когда ДНК копируется (реплицируется) до деления клетки, но ее проводят в контролируемых условиях в лаборатории. Используемая машина называется просто ПЦР-машиной или термоциклером. Пробирки, содержащие интересующую смесь ДНК, помещают в машину, и машина меняет температуру в соответствии с каждым этапом процесса.
Стандартные ингредиенты в смеси:
- интересующий сегмент ДНК
- специфические праймеры
- термостойкий фермент ДНК-полимераза
- четыре различных типа нуклеотидов ДНК
- соли, необходимые для создания подходящей среды для фермент действовать.
Что такое процесс ПЦР?
Шаг 1: денатурация
Как и при репликации ДНК, две цепи двойной спирали ДНК необходимо разделить.
Разделение происходит за счет повышения температуры смеси, в результате чего водородные связи между комплементарными цепями ДНК разрываются. Этот процесс называется денатурацией.
Шаг 2: Отжиг
.PCR
Создано Джорджем Райсом, Государственный университет Монтаны
ПЦР - это высшее биотехнологическое изобретение -
«ПЦР изменила молекулярную биологию, значительно расширив возможности по идентификации, манипулированию и воспроизведению ДНК. Она делает изобилие то, что когда-то было дефицитом - генетический материал, необходимый для экспериментов».
Пол Рабинов
(Making PCR, A Story of Biotechnology, University of Chicago Press, 1996)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), которую иногда называют «молекулярным фотокопированием», представляет собой быстрый и недорогой метод, используемый для «амплификации» - копирования - небольших сегментов ДНК.Поскольку для молекулярного и генетического анализа необходимы значительные количества образца ДНК, исследования изолированных фрагментов ДНК практически невозможны без ПЦР-амплификации. ПЦР, которую часто называют одним из самых важных научных достижений в молекулярной биологии, произвела революцию в изучении ДНК до такой степени, что ее создательница, Кэри Б. Маллис, была удостоена Нобелевской премии по химии в 1993 году.
(из Национального института исследования генома человека (подробнее)) Для чего он используется?После амплификации ДНК, полученная с помощью ПЦР, может использоваться во многих различных лабораторных процедурах, таких как:
- Большинство методов картирования в проекте «Геном человека» основаны на ПЦР.
- ПЦР используется в ряде новых лабораторных и клинических методов, включая снятие отпечатков пальцев ДНК (например, CSI и поимка преступников).
- Диагностика болезней и генетических нарушений.
- Обнаружение бактерий и вирусов в окружающей среде.
- Анализ микробных сообществ.
Как это работает?
Чтобы амплифицировать сегмент ДНК с помощью ПЦР, образец сначала нагревают, чтобы ДНК денатурировала или разделялась на два фрагмента одноцепочечной ДНК.Затем фермент под названием «Taq-полимераза» синтезирует - строит - две новые цепи ДНК, используя исходные цепи в качестве матриц. Этот процесс приводит к дублированию исходной ДНК, при этом каждая из новых молекул содержит одну старую и одну новую цепь ДНК. Затем каждую из этих нитей можно использовать для создания двух новых копий и так далее, и так далее. Цикл денатурирования и синтеза новой ДНК повторяется от 30 до 40 раз, в результате чего получается более одного миллиарда точных копий исходного сегмента ДНК.Весь цикл ПЦР автоматизирован и может быть завершен всего за несколько часов. Он управляется машиной, называемой термоциклером, которая запрограммирована на изменение температуры реакции каждые несколько минут, чтобы обеспечить денатурирование и синтез ДНК.
Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР). (авторская лаборатория Брюса Фоука)
Приборы, используемые в ПЦР -
Термоциклер или ПЦР-аппарат - это лабораторный аппарат, используемый для ПЦР.Устройство имеет термоблок с отверстиями, в которые можно вставить пробирки с реакционными смесями для ПЦР. Циклер затем повышает и понижает температуру блока дискретными, предварительно запрограммированными шагами. Термоциклеры оснащены горячей крышкой, которая представляет собой нагретую пластину, которая прижимается к крышкам реакционных трубок. Это предотвращает конденсацию воды из реакционных смесей на внутреннюю поверхность крышек и делает ненужным использование масла для ПЦР. Ссылки по теме
- Веб-ссылки для ПЦР, включая такие ресурсы, как введение и история ПЦР, а также множество ресурсов для альтернативных методов ПЦР.
Преподавательская деятельность
Следующие ресурсы были первоначально доступны через коллекцию цифровых ресурсов BioSciEd Net (BEN), которая представляет собой Национальную научную цифровую библиотеку (NSDL) (этот сайт может быть не в сети). Путь к образованию в области биологических наук. Дополнительные учебные ресурсы можно найти на сайте BEN, чтобы использовать их базу данных с возможностью поиска. BEN можно использовать бесплатно, но требуется регистрация.
- Используйте ПЦР и один волос для получения отпечатка пальца ДНК - этот PDF-документ содержит подробное руководство по протоколам и инструктивную информацию для выполнения студенческих лабораторных упражнений по молекулярной биологии и генетике, в которых студенты используют полимеразную цепную реакцию для создания отпечатков ДНК. из собственных волос.Он включает конспекты студентов, заметки инструктора и предлагаемые вопросы для лабораторных отчетов. ПО ЭТОЙ ССЫЛКЕ НА РЕСУРСЫ ТРЕБУЕТСЯ РЕГИСТРАЦИЯ (БЕСПЛАТНО) У BEN.
- ПЦР с обратной транскрипцией - этот ресурс от MicrobeLibrary.org предлагает флэш-анимацию, показывающую, как выполняется метод ПЦР с обратной транскрипцией и создаются некоторые образцы данных. Он использует звук и идентификацию при наведении указателя мыши, чтобы помочь студентам узнать больше и сохранить информацию.
